ELISA操作指南——酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay,EIA)，是將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應的特異性相結合的一種微量分析技術。酶標記抗原抗體后形成的酶標記物，既保留抗原或抗體的免疫活性，又保留酶的催化活性。當酶標記物與待測樣品中相應的抗原或抗體相互作用時，可形成酶標記抗原抗體復合物。利用復合物上標記的酶催化底物顯色，其顏色深淺與待測樣品中抗原或抗體的量相關。該方法靈敏度可達到ng~pg/ml水平。常用的標記物有辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP等。酶免疫測定分為酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和酶免疫組化技術(enzyme immunohistochemistry technique)，前者用于測定可溶性抗原或抗體，后者用于測定組織或細胞表面的抗原。

酶免疫技術

均相酶免疫測定技術

以標記抗體檢測標本中的抗原為例，按照簡單的形式在試劑抗體過量的情況下進行：

　　Ab*+Ag—Ab*Ag+Ab*

如在抗原抗體反應后Ab*Ag中的標記物“*"失去其特性，例如酶失去其活性，則不需要進行Ab*Ag與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab*量，從而間接推算出標本中的Ag含量，這種方法稱為均相酶免疫測定。

均相酶免疫測定的測定對象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測定。均相酶免疫測定的測定模式為競爭抑制法，酶標記的是待測抗原，檢測試劑中尚有針對待測抗原的抗體和酶的底物。與抗體結合的酶就失去其活力，因此在反應中無需分離結合的酶與游離的酶即可進行測定。其反應過程與一般的生化測定無異，因此可直接用自動生化分析儀進行測定。均相酶免疫測定主要有酶擴大免疫測定技術和克隆酶供體免疫測定兩種。

異相酶免疫測定技術

酶免疫技術是以酶標記的抗體或抗原為主要試劑進行檢測的方法，是標記免疫技術的一種，1966年Nakene和Pierce利用酶使底物顯色的作用而得到與熒光抗體技術相似的結果，20世紀70年代初，酶標抗體技術開始應用于免疫測定，其后得到迅速發展。近年來標記免疫技術飛速發展，應用不同標記物，根據不同原理、不同技術建立起來的檢測方法層出不窮。

酶免疫測定(enzymeimmunoassay，EIA)是以酶作為標記物的免疫測定方法，利用酶的高效催化作用提高檢測的敏感度。根據抗原抗體反應后是否需要分離結合的與游離的酶標記物，酶免疫測定可分為均相(homogenous)和異相(heterogenous)兩種類型。相對于均相酶免疫測定技術，異相酶免疫測定在醫學檢驗應用更為廣泛，其反應過程中需經過結合標記物和游離標記物的分離才能進行測定。分離的方法主要借助固相載體，即將一種反應物固定在固相載體上，當另一種反應物與之結合后，可通過洗滌、離心等方法令其與液相中的其他物質分離，此類反應亦稱為固相酶免疫測定。Engvall和Perimann于20世紀70年代初首先建立這種方法，稱之為ELISA。所謂的免疫吸附劑指的是吸附在固相載體上的免疫活性物質ELISA在臨床及科研中應用極為廣泛，已成為固相酶免疫測定的代名詞。

固相酶免疫測定方法

固相酶免疫測定主要是指ELISA，其基本原理是：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面(包被)，并保持其免疫活性；用酶標記(另一種)抗原或抗體，保留其免疫活性和酶活性；在測定時，把待測標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例；加入酶反應的底物后，底物被酶催化顯色，故可根據顏色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，具有放大反應的效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。根據測定對象的不同，ELISA有多種反應類型。