細胞生物活性的化學檢測法

細胞生物活性的化學檢測法
一、四唑鹽(MTT)比色法：
檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色法試驗(MTT)。此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，并沉積在細胞中，而細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶聯免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1 x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種于96孔培養板中，每孔100ul。
●將培養板置CO2培養箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養3-5天。
●培養3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，繼續置培養箱孵育3-6h，終止培養，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養數小時，將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度(OD)，選波長490nm。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。
用此法測細胞活力，為保證結果的準確性，在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，再確定每孔細胞接種數和培養時間，以保證培養終止時不會過滿。另外，實驗時設空白對照，比色時，以空白孔調零。
二、細胞蛋白質含量測定法(考馬斯亮藍測定法)：
基本原理為：考馬斯亮藍在酸性溶液與蛋白質結合，在595nm波長處呈zui大吸收，其OD值與蛋白質含量成正比。主要用于測定妹、受體及細胞外代謝物的特異性活性。
●用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制成懸液，用含10%胎牛血清的RPMI培養基調整細胞濃度為1×104個/ml，接種24孔培養板，每孔1ml，置37℃、5%CO2條件下培養一段時間。
●用胰蛋白酶消化分散，培養板的細胞懸浮在PBS中，細胞計數，取106細胞以1000r/min離心5min，棄上清，加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH，置100℃煮3min，使細胞裂解。
●取0.1考馬斯亮藍染液與100ul上述細胞裂解液混勻，放置10min。
●用可見光分光光度計在595nm波長處測定溶液的OD值。以溶劑為空白對照，以已知量的牛血清蛋白為標準品，繪制標準曲線。然后根據曲線推算樣品中蛋白質含量。
三、細胞蛋白質合成測定法(3H-亮氨酸摻入法)：
基本原理為：細胞在合成蛋白質時需要攝取外源性氨基酸，用同位素標記氨基酸如3H-亮氨酸可以摻入細胞蛋白合成代謝中，通過測定細胞的放射性強度，可了解細胞蛋白質合成代謝情況。
●取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的RPMI培養基中，調整細胞密度107-109個/L，接種于24孔培養板，每孔1ml。
●將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養至細胞處于對數生長期時，每孔100ul預溫37℃的3H-亮氨酸。
●繼續培養4-24h。
●終止培養，取出培養板，小心吸取培養上清，用預冷的PBS洗滌，晾干。如果細胞松散，可先用甲醇固定10min。
●把培養板放在冰蓋上，每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10min，吸取上清。
●甲醇洗滌、晾干。
●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH，1%SDS，室溫下放置30min。
●混勻，移入閃爍液，用液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數(cpm)，以cpm/106細胞或cpm/mg蛋白表示。
對懸浮生長的細胞則采用離心法處理。
四、細胞DNA合成測定法：
1、3H-TdR摻入法
基本原理為：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA*的堿基，也是DNA合成的必需物質。用同位素3H標記即3H-TdR作為DNA合成的前體摻入DNA合成代謝過程中，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DNA的代謝及細胞增殖情況。
(一)方法一
●取對數生長期細胞，制成3 X 10^8個/L的細胞懸液，接種于24孔培養板中，每孔1ml。
●將培養板放入37℃、5%CO2培養箱中培養24h左右。
●在細胞處于對數生長期時，每孔加入100ul3H-TdR(用HBSS)配制，3.7 X 10^8 Bp/L過濾除菌，使終濃度為3.7 X 10^7 Bp/L。
●繼續培養1-24h。
●終止培養，小心吸棄上清，用HBSS漂洗單層細胞2次，然后加入2mo預冷的10%TCA，放置10min。如果細胞松散，應先用固定甲醇10min，用液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數，結果以cpm/10^6細胞表示。
(二)方法二
●同方法一*步。
●將培養板放入37℃、5%CO2培養箱中培養56h左右。
●每孔加入100ul 3H-TdR。
●繼續培養16h。
●終止培養，將細胞收集于49型濾膜上，如為貼壁細胞，吸棄培養上清后，用0.25%胰蛋白酶消化2-5min；如為血細胞，先用蒸餾水破紅細胞。然后再收集細胞，收集后要加10%CTA和甲醇固定。
●將濾膜烘干后移入已知有3min閃爍液的閃爍瓶中，在液體閃爍計數儀上測定每分鐘脈沖數或衰變數，結果以cpm/10^6細胞或dpm/10^6細胞表示。
2、流式細胞儀測定DNA合成
用流式細胞儀測定細胞增殖周期和DNA合成是20世紀90年代發展起來的新手段，不僅快速、準確、效果好，而且消除了同位素標記的許多繁瑣方法和放射性污染。
●取80%匯合至接近*匯合的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備成單細胞懸液，細胞密度1想0^9個/L，注意不要留有細胞碎片。
進行流式細胞儀檢測。除檢測細胞周期時相變化和反應DNA合成外，還可了解染色體倍性；結合熒光免疫法，還可對細胞膜進行分析等。

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